Kanker serviks merupakan kanker yang paling banyak diderita wanita Indonesia dengan 98.692 kasus pada tahun 2013. Pengobatan kanker seperti kemoterapi dengan 5-fluorourasil (5-FU) memicu terjadinya efek samping berbahaya selama pengobatannya. Oleh karena itu, perlu dikembangkan agen kokemoterapi dari bahan alam yang dikombinasi dengan kemoterapi untuk meminimalkan efek samping dengan berkurangnya dosis kemoterapi. Bandotan (Ageratum conyzoides L.) mengandung senyawa flavonoid seperti nobiletin yang diperkirakan menghambat viabilitas sel kanker. Tujuan penelitan ini adalah menentukan aktivitas kombinasi Fraksi Kloroform Bandotan (FKB) dan 5- Fluorourasil (5-FU) berdasarkan uji in vitro dan in silico. Identifikasi kandungan senyawa flavonoid secara kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Uji sitotoksik metode MTT Assay kombinasi FKB dan 5-FU terhadap sel HeLa untuk mengetahui viabilitas sel. Molecular Docking senyawa bandotan yaitu nobiletin terhadap protein Bcl-xl. Hasil identifikasi KLT, senyawa flavonoid FKB ditunjukan oleh bercak berwarna kuning, biru muda, ungu tua dan ungu muda pada UV 366 dengan Rf masing-masing 0,181, 0,287, 0,312 dan 0,350. Uji kombinasi menunjukkan efek sinergis terdapat pada kombinasi 3,75 μg/ml FKB (1/8 IC50) dan kadar 5,625 μg/ml 5-FU (1/8 IC50) dengan nilai CI 0,36 dan 49,92% viabilitas sel HeLa. Adapun hasil molecular docking memperlihatkan bahwa senyawa flavonoid nobiletin lebih baik dalam menghambat ekspresi protein Bcl-xl dengan energi afinitas -8,0 kcal/mol dibandingkan 5-FU, ligan asli 4FC dan TH1 dengan energi afinitas -4,7, -6,9 dan -6,2 kcal/mol. Berdasarkan hasil KLT, uji sitotoksik dan molecular docking, FKB potensial untuk dikembangkan sebagai salah satu agen ko-kemoterapi untuk kanker serviks.